크라이오의 자동 유리화

Nature Communications 13권, 기사 번호: 2985(2022) 이 기사 인용

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저온전자현미경의 데이터 수집 및 이미지 처리 속도와 효율성은 지난 10년 동안 증가했습니다. 그러나 극저온 표본 준비 기술은 뒤처지고 더 빠르며 더 재현 가능한 표본 준비 장치가 필요합니다. 여기에서는 제한된 사용자 상호 작용만 필요로 하는 고도로 자동화된 시료 처리 기능을 갖춘 유리화 장치를 제시합니다. 또한 이 장치는 종이를 적시는 것이 아니라 튜브에 의한 흡입을 통해 과잉 액체를 제거하기 때문에 광학 현미경을 사용하여 얇은 필름을 검사할 수 있습니다. 이슬점 제어와 결합하여 제어되고 재현 가능한 방식으로 박막 준비가 가능합니다. 장점은 준비된 극저온 표본의 품질이 전자 현미경 데이터 수집 전에 특성화된다는 것입니다. 장치의 실용성과 성능은 단백질 현탁액, 지질 소포, 박테리아 및 인간 세포의 유리화에 이어 단일 입자 분석, 저온 전자 단층 촬영 및 저온 상관 광 및 전자 현미경을 사용하여 이미지화하여 얻은 실험 결과로 설명됩니다.

생물학적 시료를 급속 냉동하여 유리수(무정형 얼음)에 극저온 고정하면 단백질 현탁액, 바이러스, 박테리아 및 진핵 세포와 같은 생물학적 시료의 구조를 거의 완벽하게 보존할 수 있습니다. 극저온 고정에는 얼음(결정) 형성이 방지될 만큼 충분히 높은 동결 속도(>100,000 °C/s)가 필요합니다. 그 결과, 물은 유리와 같은 비정질, 준안정 과도 상태를 갖게 됩니다1. 유리화를 사용하면 단백질과 세포의 구조가 원래의 수화 환경에서 원자 분해 수준까지 보존될 수 있습니다. 유리화된 시료는 저온전자현미경(cryo-EM)에 필요한 진공 조건과 호환되며 광학 저온형광현미경(cryofLM)2으로도 연구할 수 있습니다. 상관광전자현미경(CLEM)3은 EM(고해상도, 구조적 맥락)의 장점과 다양한 광학 현미경 기술(실시간 이미징, 다양한 라벨링)의 장점을 결합합니다4,5.

액체 에탄 또는 에탄/프로판 혼합물을 극저온으로 사용하는 급락 동결을 통한 유리화는 최대 10미크론 두께의 생물학적 시료를 극저온 준비하기 위한 실용적인 접근 방식인 것으로 나타났습니다1,7. 극저온 EM의 경우 정제된 단백질과 바이러스 현탁액은 수십 나노미터를 측정하는 얇은 수층에 보존되며, SPA8,9를 사용하여 원자 분해능 재구성을 결정할 수 있습니다. 박테리아 및 최대 수 마이크론 두께의 부착 세포와 같은 더 큰 구조도 유리화에 적합합니다. 분자 분해능을 갖춘 3차원 재구성은 최대 약 0.5 마이크론 두께의 샘플에 대한 저온 전자 단층 촬영(cryo-ET)을 사용하여 결정할 수 있습니다10,11. 샘플을 둘러싼 매체가 전자를 산란시켜 이미지의 배경 노이즈를 추가함으로써 이미지의 신호 대 잡음 비율을 낮추고 3차원 재구성 결과에서 달성 가능한 해상도를 감소시키기 때문에 액체 층의 두께를 최소화하는 것이 중요합니다.

EM용 전자 현미경 시편 지지대(일반적으로 직경 3.05mm 구리 그리드로 지지되는 구멍이 많은 탄소 층)에 얇은 액체 샘플 층을 생성하는 필수 단계는 문제가 있습니다. 얇은 수층은 본질적으로 불안정하고 정확한 제어가 가능하기 때문입니다. 수층 두께가 어렵습니다. 공기 또는 알킬아민12,13에서 글로우 방전을 통해 지지 필름을 친수성으로 만드는 것은 지지 필름에 얇은 액체 층을 형성하는 데 도움이 되며 습하고 포화된 환경은 얇은 층을 안정화하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다. 현재 일반적인 관행은 글로우 방전 지지 필름에 몇 마이크로리터의 표본 용액을 적용한 다음 여과지를 사용하여 과도한 액체를 닦아낸 다음 급락 냉동시키는 것입니다.